Günümüz Ayasofya'sı İmparator Justinianos (527-565) tarafından dönemin iki önemli mimarı olan Miletos'lu (Milet) İsidoros ile Tralles'li (Aydın) Anthemios'a yaptırılmıştır.
Tarihçi Prokopios'un aktardığına göre, 23 Şubat 532 yılında başlayan inşa, 5 yıl gibi kısa bir sürede tamamlanmış ve kilise 27 Aralık 537 tarihinde Aziz İstepan Bayramı'nda törenle ibadete açılmıştır. Kaynaklarda, Ayasofya'nın açılış günü İmparator Justinianos'un, mabedin içine girip, "Tanrım bana böyle bir ibadet yeri yapabilme fırsatı sağladığın için şükürler olsun" dedikten sonra, Kudüs'teki Hz. Süleyman Mabedi'ni kastederek "Ey Süleyman seni geçtim" diye bağırdığı geçer.
Ayasofya Doğu Roma Döneminde İmparatorluk Kilisesi olması nedeniyle İmparatorların taç giyme merasimlerinin yapıldığı mekândı. Bu sebeple Ayasofya'da ana mekanın (naos) sağında bulunan, renkli taşlardan yuvarlak ve geçmeli desenli yer döşemesi (omphalion), Doğu Roma İmparatorlarının taç giydiği bölümdür.
IV. Haçlı Seferi sırasında İstanbul Latinler tarafından 1204- 1261 yılları arasında işgal edilmiş, bu dönemde gerek kent, gerekse Ayasofya yağmalanmıştır. 1261 yılında Doğu Roma kenti tekrar ele geçirdiğinde, Ayasofya'nın oldukça harap durumda olduğu bilinmektedir.